2基于“五原则”的基于鹿茸Q-Marker辨识分析

Q-Marker由刘昌孝院士于2016年创新性地提出，即中药材和中药产品中固有的中药质量或加工制备过程中形成的、与中药功能属性密切相关的标志化学物质，能反映中药安全性和有效性的基于标示性物质。Q-Marker需同时满足中医药理论相关性、中药质量特有性、标志有效性、基于可测性和传递与溯源性5大基本原则。中药质量基于“五原则”的标志Q-Marker辨识分析对鹿茸Q-Marker的筛选具有重要意义。

2.1鹿茸中Q-Marker的基于有效性

有效性是Q-Marker的核心要素，有效性主要体现在药性、中药质量药效和入血成分及其代谢产物等。标志鹿茸始载于《神农本草经》，基于位列中品，中药质量谓：“鹿茸味甘，标志性温……主漏下恶血，寒热惊痫，益智强智，生齿不老”，历代本草及药典中均有收载。《中国药典》2020年版鹿茸项下描述包括“味甘、咸；归肾、肝经；具有壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒的功效，主治肾阳不足，精血亏损，阳痿滑精，宫冷不孕，羸瘦，神疲，畏寒，眩晕，耳鸣，耳聋，腰脊冷痛，筋骨痿软，崩漏带下，阴疽不敛”。

通过对古籍及《中国药典》的考察不难发现，药性方面，鹿茸性温，具有补肾壮阳之功效，鹿茸可以通过兴奋下丘脑-垂体-性腺内分泌轴使血液中性激素含量升高。味甘、咸，甘味系其中丰富的多糖、氨基酸等成分，与调节机体免疫力、抗骨质疏松等药理功能密切相关；咸味系其中的矿质元素，具有抗菌、抗炎等功效。归肾、肝经，具有壮肾阳功效的鹿茸入肾经，符合中医认为肾主生殖的理论。药效方面，现代药理学研究表明，鹿茸具有抗骨质疏松、抗衰老、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、抗抑郁、抗肝损伤、增强记忆力、提高机体免疫力及性激素样作用等多种药理活性。吕经纬等通过网络药理学研究获得了鹿茸中的17β-雌二醇、氨基葡萄糖、雌酮、D-葡萄糖醛酸等14个成分及306个靶点，发现了甲状腺受体相互作用蛋白2、腺苷酸环化酶1型等26个关键靶点蛋白，进一步揭示了鹿茸在治疗骨质疏松和抗肿瘤方面具有潜在的优势。

然而，鹿茸中入血成分及其代谢产物的研究相对较少，Yu等通过体外模拟鹿茸胃肠道消化反应，采用LC-MS/MS鉴定分析了鹿茸水提物、胃液消化物和胰液消化物中23、387、417个肽段，研究表明胶原蛋白是鹿茸中的主要蛋白质，在胃消化物中释放了34种多肽，在胰消化物中释放了146种多肽。关于鹿茸中入血成分及其代谢产物的研究有待进一步加强。

2.2鹿茸中Q-Marker与中医药理论的相关性

中药配伍是中医药理论的核心内容，中药配伍后能显著影响药效物质基础与作用机制，同一药材在不同处方中以“君、臣、佐、使”发挥不同的药效。Q-Marker的筛选要求延伸到临床应用层面，应基于中药临床应用最终效应成分及其功效的临床表达形式确定Q-Marker。林贺等系统整理了自汉至清的中医药典籍发现，中医药古籍和传统方剂中含鹿茸的方剂包括800余首，充分扮演了“君、臣、佐、使”的角色，鹿茸用量在1分～2斤8两，大部分用量在2钱～4两，用法上常与肉苁蓉、菟丝子、附子、当归、牛膝、人参、五味子等配伍使用，发挥壮肾阳、益精血、强筋骨之功效。

鉴于中药方剂“君、臣、佐、使”的配伍原则，鹿茸中Q-Marker的筛选需充分考虑其配伍环境，一方面应与鹿茸“壮肾阳、益精血、强筋骨”的临床疗效密切相关，另一方面鹿茸中的Q-Marker含量应相对较高，避免其在复方中用量较低时难于检测。

2.3鹿茸中Q-Marker的特有性

特有性是中药鉴别、质量控制和评价的核心，具有专属性，主要体现在2个层次：（1）能代表和反映同一类药材的共有性并区别于其他药材的特征性成分；（2）能反映同一类、不同种药材之间的差异性成分。鹿茸Q-Marker特有性的内涵包含系统演化、亲缘关系学、生物学特性和特异性成分等，又与道地产区，不同形态、生长阶段和产地初加工方式等密切相关。

2.3.1鹿茸的共性及区分于其他物种的特异性

(1）基于系统演化和亲缘关系学分析的鹿茸Q-Marker筛选：《中国药典》2020年版一部中明确规定鹿茸基原为鹿科动物梅花鹿和马鹿雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，但目前市场上鹿茸基原混杂，大量伪品充斥市场，主要包括赤鹿茸、驯鹿茸和驼鹿茸。由于遗传物质的差异，不同物种形态及化学成分均会表现出差异，最终影响中药的疗效。

现代分子生物学技术的发展为鹿科动物系统演化和亲缘关系分析提供了可靠的技术手段，鞠妍等以线粒体DNA序列差异为依据分析了鹿科动物的系统进化关系（图1），研究表明以线粒体DNA为依据能将梅花鹿、马鹿、驯鹿、驼鹿等20多种鹿科动物系统分为鹿亚科、麂亚科、空齿鹿亚科和獐亚科，其中梅花鹿和马鹿为亲缘关系最近的姐妹群，并能与驯鹿、驼鹿等明显区分开。贾静等以DNA条形码对71份市售鹿茸粉药材进行鉴定，其中38%为《中国药典》2020年版规定的基原，62%为其他基原，以驯鹿为主。

截止目前，《中国药典》2020年版中采用PCR法进行基原鉴别的药材包括蕲蛇、乌梢蛇和川贝母，应用DNA分子鉴别中药基原得到了业界广泛的认可，《中国药典》中将PCR法应用于中药基原的鉴别有逐渐增加的趋势。以分子生物学技术筛选梅花鹿、马鹿中的特异性DNA片段构建鹿茸基原的鉴别方法具有较好的应用前景。

此外，在物种遗传物质不同的基础上，其调控体内所表达的蛋白质等具有高度特异性。《中国药典》2020年版采用液质联用的方法分析阿胶、龟甲胶和鹿角胶中特异性肽段，进而控制中药基原。中国食品药品检定研究院最新的研究表明，梅花鹿茸、马鹿茸和驯鹿茸中有明显的特异性多肽，可以通过主成分和偏最小二乘法等分析方法进一步筛选、鉴别。

(2）生物学特性结合化学成分分析的鹿茸Q-Marker筛选：药用植物能够在体内通过乙酸-丙二酸途径、甲戊二羟酸途径、莽草酸途径、氨基酸途径及其复合途径等生源途径代谢产生苯丙素类、醌类、黄酮类、萜类和生物碱类等成千上万的次生代谢产物，其在植物中的生成和分布通常具有种属、组织器官和生长发育期的特异性。对药用植物次生代谢产物及其生源途径特异性分析有助于Q-Marker的筛选。然而，动物药中通常无特异性次生代谢产物，次生代谢产物代谢路径研究少且不深入导致动物药中Q-Marker的筛选较为困难。但鹿茸因其由软骨组织发育且具有周期性脱落等独特的生物学特性（图2），为鹿茸中Q-Marker的筛选提供了较好的切入点。

首先，鹿茸为典型的动物药，胶原蛋白是动物异于植物的重要结构蛋白，主要存在于动物结缔组织（皮肤、肌肉）、骨骼、软骨等，具有促进伤口愈合、润滑关节等功能。其中羟脯氨酸是构成胶原蛋白的特异性氨基酸，不参与其他蛋白质的合成，系胶原蛋白合成过程中已合成肽链中的脯氨酸被羟化酶转化而成。《中国药典》2020年版采用异硫氰酸苯酯柱前衍生HPLC法对阿胶、龟甲胶和鹿角胶中羟脯氨酸进行含量测定，并对3种胶类中药中羟脯氨酸含量提出限量标准。本课题组采用氨基酸自动分析仪对鹿茸中羟脯氨酸进行含量测定发现，梅花鹿茸和马鹿茸中均能检出羟脯氨酸且含量差异不显著，不同加工和炮制方式鹿茸中羟脯氨酸含量最低为2.49%。

其次，鹿茸不同于其他动物药，系软骨组织发育而来，硫酸软骨素是高等动物软骨组织中特有的酸性黏多糖，具有抗关节炎、抗骨质疏松和抗肿瘤等生物学活性，能够部分代表鹿茸的临床疗效，是鹿茸中相对特异的化学成分。本课题组前期研究发现，鹿茸中硫酸软骨素存在形式以硫酸软骨素A、B和C为主，梅花鹿茸和马鹿茸中均能检出硫酸软骨素且含量差异不显著，不同部位和规格鹿茸中硫酸软骨素含量存在显著差异，鹿茸中硫酸软骨素质量分数最低为960 mg/kg，鹿角仅为410mg/kg。吕经纬等通过网络药理学研究发现，鹿茸中硫酸软骨素的重要组成单元氨基葡萄糖能够协同其他多个化学成分通过腺苷酸环化酶1型等10个关键靶点作用于癌症信号通路，提示氨基葡萄糖具有抗肿瘤和增强免疫力的作用。因此，以生物学特性、化学成分特异性、药效物质基础和药理作用为考量因素，硫酸软骨素是鹿茸中Q-Marker的不错选择。

此外，鹿茸是迄今为止发现的哺乳动物中唯一可再生的器官，其中含有丰富的血管、神经等组织，γ-氨基丁酸是一种非蛋白组成氨基酸，在哺乳动物中仅存在于神经组织中，具有抗疲劳、促睡眠等作用。\本课题组对鹿茸、鹿角、鹿角霜及鹿角胶等鹿制品中γ-氨基丁酸进行含量测定发现，梅花鹿茸和马鹿茸中均能检出γ-氨基丁酸，且含量差异不显著，鹿茸中γ-氨基丁酸质量分数最低为350 mg/kg，鹿角中γ-氨基丁酸显著低于鹿茸，为130 mg/kg，鹿角霜中几乎不含γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸广泛存在于植物、动物及微生物中，作为鹿茸中Q-Marker特异性较差，但可以考虑以γ-氨基丁酸含量为辅结合其他化学成分综合评价鹿茸质量。

最后，鹿茸奇特的生物学特性还包括周期性的脱落与再生，鹿茸在春季萌生，初秋长成后褪去茸皮变成鹿角，用于交配中竞争配偶，鹿角于冬季或早春脱落。现代研究表明，鹿茸的生长和再生与动物体内性激素水平密切相关，孕酮和雄激素相互拮抗调节鹿茸的发生、生长、骨化和脱落。激素的生理功能也与鹿茸“补肾阳，调冲任”的功效密切相关。李春燕等建立了鹿茸中18种性激素的提取技术。Lu等采用GC-MS法测定了不同产地鹿茸中18种激素含量，发现不同产区及部位鹿茸中性激素含量差异显著。激素作为鹿茸中Q-Marker具有一定的特异性，但因激素具有微量、高效的特点，其在鹿茸及鹿制品中含量低且难于检测，鹿茸以贵细药材在中药复方中少量使用时更加难于检测。

综上所述，基于系统演化和亲缘关系学分析的DNA及特异性肽段为鹿茸基原真伪的鉴别提供了保障，生物学特性结合化学成分分析的羟脯氨酸、硫酸软骨素、γ-氨基丁酸和激素等多指标相结合的Q-Marker为鹿茸质量控制提供了新的思路。

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